O artigo abaixo foi publicado pela ThermoFisher Scientific e traduzido do inglês para o português por Thais Santos, especialista de produtos da Datamed

Manutenção E Cuidados Apropriados Para Uma Incubadora De Células 

Introdução

Hoje, existem muitas incubadoras de CO2 diferentes, em laboratórios diferentes, em todo o mundo. Todas elas compartilham algumas semelhanças.

Você confia seu trabalho – suas células – à sua incubadora. Ter uma incubadora bem projetada e funcionando adequadamente significa que você nunca terá que se preocupar com isso. Em uma incubadora assim, suas células crescem bem, problemas de contaminação são raros e a incubadora é fácil de limpar e manter.

Todos que usam uma incubadora para cultura de células precisam entender alguns pontos importantes para mantê-la funcionando da melhor maneira possível. As informações apresentadas aqui te ajudarão a evitar erros comuns que podem atrasar no projeto. Tenha em mente que, embora essas recomendações sejam geralmente aplicáveis a qualquer incubadora de CO2, sugerimos que consulte o manual do usuário para se certificar de que não está contrário às práticas recomendadas do fabricante.

Posicionando a incubadora de CO2

O local onde você coloca a incubadora pode alterar seu desempenho. Ventilação, fluxo de ar, temperatura ambiente e luz solar direta podem afetar o controle de temperatura e umidade. Ao instalar uma incubadora de CO2, certifique-se de levantá-la apenas pelos lados da parte inferior, nunca da frente e de trás – e nunca levante usando a porta como ponto de apoio. Posicione a incubadora em uma superfície firme e nivelada, longe de qualquer fonte de vibração. Nunca instale uma incubadora diretamente no chão. Em vez disso, use um suporte. Se a incubadora ficar diretamente no chão, o movimento de ar que é criado toda vez que a porta é aberta levará sujeira, poeira e contaminantes diretamente para a câmara de cultura.

Ao empilhar incubadoras, você deve apenas empilhar marcas semelhantes. Se você empilhar unidades diferentes, corre o risco de a pilha tombar ou a unidade superior cair, já que geralmente não há mecanismo para proteger as incubadoras que não combinam. Em seguida, verifique se há folga adequada em todos os lados da incubadora. Isso permite a ventilação e o acesso a cabos e conectores de energia, incluindo conexão a gás.

Tente colocar a incubadora longe das áreas de tráfego, mas evite cantos úmidos e úmidos que possam abrigar o crescimento de fungos. Certifique-se de que a unidade esteja protegida da ventilação e de outras correntes de ar, pois essas correntes de ar podem direcionar a contaminação, transportando poeira e sujeira para dentro da incubadora.

Não posicione a incubadora sob a luz direta do sol, porque a flutuação das temperaturas externas pode afetar as funções de anti-condensação. Finalmente, certifique-se de que a incubadora está nivelada – tanto da frente para trás quanto de um lado para o outro – ajustando os pés de nivelamento ou o suporte.

Instalação

Cada modelo de incubadora é diferente em relação a conexões e programação, mas existem algumas diretrizes gerais que se aplicam a todas as incubadoras. A instalação adequada da incubadora desde o início ajudará a fornecer as melhores condições para as células daqui para frente. Depois que a incubadora estiver posicionada corretamente, limpe e desinfete o interior da incubadora, as prateleiras e suportes da prateleira e os dutos de ar, se aplicável (veja abaixo as recomendações de limpeza). Após a desinfecção, instale esses e quaisquer outros componentes internos, seguindo as instruções do fabricante.

Nota: Se um ciclo automático de descontaminação / esterilização por calor estiver disponível, você pode pular a etapa de desinfecção manual e simplesmente executar o programa automático – assumindo que o programa está comprovadamente eliminando os organismos indicadores biológicos aceitos. Um programa automático de alta temperatura também elimina a necessidade de autoclavar qualquer peça interna. É importante mencionar que, embora os modelos recentes da Thermo Scientific ™ com um ciclo de alta temperatura não exijam nenhum manuseio de peças para executar o processo, alguns modelos anteriores e muitos de outros fabricantes têm sensores que devem ser removidos primeiro.

Quando a incubadora estiver limpa, desinfetada e as peças das prateleiras estiverem no lugar, você poderá instalar qualquer peça adicional opcional, como um sensor de oxigênio ou um filtro HEPA. O sistema de filtragem HEPA da câmara em qualquer incubadora de CO2 da Thermo Scientific filtrará todo o volume de ar da câmara a cada 60 segundos, estabelecendo a qualidade de ar de sala limpa da Classe ISO 5 na câmara em 5 minutos após cada abertura da porta.

Nota: Um filtro HEPA que não esteja localizado dentro da câmara não terá as mesmas condições que as células e não poderá fornecer o mesmo nível de garantia.

Manuseie os filtros HEPA e os sensores de gás com muito cuidado, pois eles são facilmente danificados. Se você tiver uma incubadora com jaqueta de água, preencha a jaqueta neste momento. Além disso, encha a bandeja de umidade com água destilada estéril, a 1,25 cm do topo, ou preencha apenas até o indicador “max” se disponível.

Manter a bandeja cheia é importante para uma boa umidade consistente e melhores condições de crescimento. Agora, usando os componentes eletrônicos e seguindo as instruções do fabricante, defina a temperatura, a tolerância de temperatura baixa e alta temperatura, os pontos de ajuste de CO₂ e O₂ e os alarmes apropriados. Se você tiver uma incubadora Thermo Scientific com a interface iCAN ™ da Thermo Scientific ™, também poderá definir os parâmetros de registro de dados neste momento.

Dependendo de suas configurações, o iCAN coletará dados para serem armazenados a bordo por até uma semana ou exportados para o Microsoft ™ Excel ™. Muitas vezes, essas informações podem ser muito úteis, não apenas para o monitoramento do cGMP (Boas Práticas de Fabricação atual), mas também para ajudar a identificar o início de quaisquer problemas.

Monitoramento de CO₂

Existem dois tipos de sensores de gás CO₂. O primeiro é o sensor T/C (condutividade térmica). As incubadoras da Thermo Scientific oferecem um sensor T/C e componentes eletrônicos muito estáveis, precisos e econômicos. De fato, os sensores T/C são nosso método mais popular de controle de CO₂. Eles são de longa duração, comparativamente baratos e robustos. Um sensor IR (infravermelho) é preferido para algumas aplicações, incluindo monitoramento de cGMP, ou quando a porta da incubadora é aberta repetidamente durante um curto período; por exemplo, ao executar análises de expressão ao longo do tempo

Alguns fabricantes têm um design que coloca os sensores fora da câmara de incubação para evitar a necessidade de removê-los durante a esterilização; essa não é uma boa opção porque os sensores externos não terão as mesmas condições que as células. Assim, essas incubadoras não respondem rapidamente a mudanças que afetam o crescimento celular.

Conexões de gás CO₂

Para conectar os tanques de CO₂ às incubadoras Thermo Scientific, você deve usar um regulador de pressão de CO₂ de dois estágios na válvula de saída do cilindro de gás. Isso ocorre porque a pressão de entrada em nossas incubadoras deve ser mantida em 15 +/- 5 psi (libras por polegada quadrada), ou 1 barr, para o funcionamento adequado do sistema de controle de CO₂. Um regulador de estágio único simplesmente não manterá essa pressão, resultando em níveis de CO₂ imprecisos. Recomendamos o uso de gás de grau industrial que seja pelo menos 99,5% puro, porque as impurezas do gás podem afetar negativamente suas células. O tanque de gás CO₂ não deve conter tubos de sifão.

Use um regulador de dois estágios no tanque e ajuste a pressão de entrada para a incubadora a 15 psi (1 barr). Conecte a tubulação ao filtro de ar e, em seguida, ao encaixe rotulado na parte traseira da incubadora, e certifique-se de usar uma braçadeira de mangueira e verificar vazamentos de gás, que podem ser perigosos para você e seus colegas de laboratório. Quando a incubadora estiver operando normalmente por 24 horas, verifique a calibração da temperatura usando um termômetro NIST (Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia) ou outro termômetro certificado, e verifique o CO₂ usando um fyrite ou um testador IR externo.

Inserindo um equipamento extra

Alguns pesquisadores querem adicionar equipamentos elétricos, como shakers, rotators ou agitadores à incubadora de CO₂. A dificuldade com isso é que muito calor do equipamento adicionado aumenta a temperatura interna na incubadora, e esse calor extra torna difícil a compensação da eletrônica da incubadora.

Alguns shakers criam vibrações e calor, por isso é importante não definir uma rotação mais rápida do que cerca de 200 RPM (revoluções por minuto), para minimizar o movimento que pode afetar o crescimento e a adesão da célula aderente.

Teste seu shaker em diferentes velocidades com o volume necessário de líquidos e frascos para garantir que não haja calor ou vibração antes de experimentar as células. Se você souber que usará equipamentos elétricos no interior, considere comprar uma incubadora com camisa de água.

Como alternativa a um agitador, a Heracell ™ 240i da Thermo Scientific ™ oferece um conjunto de rollers para garrafas, que não produz calor. Cada um substitui uma prateleira, para que você possa adicionar até 4 dessas unidades dentro, dando-lhe flexibilidade de cultura adicional.

Reduzindo a Contaminação

Para reduzir as chances de contaminação em suas culturas, a limpeza de seu laboratório é importante. Poeira e sujeira podem voar pelo laboratório, carregadas pelas correntes de ar criadas quando as pessoas se movimentam pela sala ou abrem e fecham as portas. O ar normal da sala interior contém 100-1.000 microrganismos por metro cúbico, todos circulando em qualquer momento. A maioria destes vem dos trilhões de flora normal que vivem dentro e na nossa pele. Isso significa que toda vez que você abrir qualquer porta da incubadora, os contaminantes podem entrar.Por isso, é importante minimizar os contaminantes e a sujeira no laboratório, limpando o laboratório com frequência; pelo menos uma a duas vezes por mês.

Limpe e desinfete a cabine de segurança biológica (BSC), o banho maria, a centrífuga e o microscópio. Elimine o armazenamento de papelão em geladeiras e freezers ou em torno de reagentes e amostras, porque o papelão pode ficar molhado e, depois, criar fungos. Não guarde itens em cima da incubadora, pois poeira e sujeira entre esses itens podem ser varridos para dentro da câmara com correntes de ar criadas durante a abertura de uma porta. Lembre-se também de limpar os cantos do laboratório e sobre e sob o equipamento onde a poeira pode se acumular.

Desinfetantes da Incubadora

Muitos pesquisadores perguntam: quais desinfetantes podem ser usados na incubadora de CO₂? A verdade é que existem muitas opções de desinfetantes disponíveis, mas nem todas são seguras para as células ou para os componentes da incubadora. Alguns desinfetantes fortes podem liberar vapores que entram na incubadora e afetam o crescimento das células. Esses vapores contêm VOCs (compostos orgânicos voláteis) que podem induzir a expressão de choque térmico e outras proteínas de estresse. Produtos químicos laboratoriais comuns, como o fenol, o álcool isoamílico e o betamercaptoetanol, são compostos orgânicos voláteis, mas também produtos de limpeza de laboratório e desinfetantes, e até mesmo limpadores de piso e ceras produzem vapores nocivos. Em suma, se cheirar forte ou ruim para você, também pode ser ruim para as células cultivadas. Reconhecendo que os COVs são uma preocupação crescente para culturistas de células, algumas incubadoras da Thermo Scientific com filtragem HEPA aceitarão filtros HEPA especializados que também capturam COVs.

A equipe de tecnologia da Thermo Fisher Scientific investigou e testou vários tipos diferentes de desinfetantes. Procuramos um desinfetante que atendesse aos seguintes critérios: amplamente eficaz contra uma variedade de microrganismos; e inofensivo (não corrosivo) aos componentes da incubadora. De todos os testados, o composto que melhor atendeu às nossas exigências é um desinfetante de amônia quaternária. Este tipo básico está disponível em todas as regiões de diferentes fabricantes. Alguns exemplos incluem Lysol No Rinse (anteriormente Roccall-D), Conflikt (América do Norte) e Fermicidal-D (Europa). É importante verificar a MSDS (ficha de dados de segurança do material).

Certifique-se de que a concentração de amônia quaternária seja de 10% ou menos. Concentrações mais altas podem prejudicar as células e os componentes da incubadora ao longo do tempo. Use uma diluição de 2,98 do mesmo desinfetante de amônio quaternário que você usou para desinfetar o interior da incubadora, como um aditivo de desinfecção na bandeja de água.

Os aditivos desinfetantes para banho maria geralmente contêm concentrações muito altas de amônia quaternária ou outros produtos químicos e não devem ser usados na água da incubadora de CO₂. Essas concentrações são muito altas para a atmosfera quente, úmida e levemente ácida (devido ao gás CO₂ + umidade que produz ácido carbônico fraco) em uma incubadora de CO2. É provável que tais aditivos causem a corrosão da incubadora ao longo do tempo. Da mesma forma, o sulfato de cobre não deve ser usado a longo prazo na água. Devemos enfatizar que você nunca deve usar produtos de limpeza contendo alvejantes. O alvejante de cloro e seus derivados com atividade oxidante corroem o aço inoxidável e o cobre. Além disso, esses produtos químicos são muito tóxicos para as células!

Procedimento para limpar a incubadora

A limpeza regular da incubadora, embora às vezes seja uma tarefa rotineira, é uma necessidade para ajudar a proteger as células contra contaminação e manter a incubadora funcionando adequadamente. Seguir com cuidado estes passos simples manterá sua incubadora limpa, ajudará a reduzir as chances de uma contaminação se estabelecer e ajudará a manter suas células crescendo bem. Se você usar um ciclo automatizado de descontaminação/esterilização de calor que comprovadamente elimina bactérias e fungos, você não deve precisar usar um desinfetante, mas ainda deve limpar periodicamente a incubadora para eliminar líquidos derramados e sujeira.

Mova todas as culturas para uma incubadora diferente. Ou, se a limpeza não demorar muito, você pode armazená-las em uma caixa plástica limpa e desinfetada que as manterá aquecidas. Em seguida, desligue a incubadora, inclusive desligando o suprimento de gás. Remova todas as prateleiras, os suportes da prateleira e quaisquer suportes ou dutos de ar.

Esvazie a bandeja de água e limpe-a com um pano limpo e sem fiapos. Limpe todas as superfícies internas, dutos, prateleiras, porta interna, ventilador e juntas da porta com água com sabão. Um detergente suave funciona bem para isso. Certifique-se de alcançar todos os cantos e fendas onde a sujeira, a poeira e os germes podem se esconder. Uma incubadora com cantos arredondados facilita essa tarefa. Lave essas superfícies e peças com água destilada e limpe-as novamente com um pano limpo e sem fiapos. Limpe as superfícies e peças interiores com um desinfetante de amónia quaternária diluído (concentração de 10% ou menos). Siga limpando com álcool a 70% para remover quaisquer remanescentes do desinfetante.

Novamente, certifique-se de alcançar todos os cantos e lembre-se de limpar a borracha da porta também. Substitua as peças internas. Agora você pode ligar novamente o aquecimento da incubadora e deixa-la secar completamente. Isso deve levar apenas um momento ou dois, por isso não deixe a porta aberta – isso apenas reintroduz nova poeira e contaminantes!. Se você tem um ciclo de descontaminação / esterilização automatizado, você pode executá-lo agora. Depois que o ciclo estiver completo, encha a bandeja de umidade com água destilada estéril e ligue o suprimento de gás.

Lembre-se de limpar o exterior da incubadora para eliminar sujeira e microrganismos que possam encontrar o caminho para dentro. Se a parte superior da sua incubadora estiver muito empoeirada, é provável que a poeira esteja passando para a incubadora quando você abre a porta, por isso é importante limpar a parte superior também.

Use um pano sem fiapos umedecido em água com sabão suave. Em seguida, limpe usando um pano limpo levemente umedecido em água limpa. Seque o exterior com um pano limpo e seco. Preste atenção especial às maçanetas das portas, onde todos tocam. Não use líquidos ou produtos de limpeza para limpar superfícies ou touchscreens. Em vez disso, use um pano de microfibra seco para limpá-los

É isso aí, você terminou! Quando a incubadora atingir as condições estabelecidas, retorne as células para dentro. Muitas vezes nos perguntam “como faço para limpar minha incubadora de cobre 100% puro?” Você pode usar o mesmo procedimento para limpar o cobre que usaria com aço inoxidável, incluindo água com sabão, seguida de um lenço com etanol a 70%. Não é necessário usar um desinfetante de amônio quaternário, devido às propriedades inerentes do cobre

Importância da Água Correta

Para fornecer a umidade adequada exigida pelas células cultivadas, recomendamos apenas água destilada estéril. A água da torneira, mesmo com pequenas quantidades de cloro, pode corroer o aço inoxidável ou o cobre puro. Além disso, a água da torneira pode conter muitas bactérias e minerais. Uma vez que os sais e minerais são precisamente equilibrados em meios de crescimento celular, a adição de minerais através da água para a atmosfera humidificada pode causar um crescimento celular deficiente. Água DI (desionizada) ou ultra-pura água Tipo 1 é muito agressiva. Elas corroem o aço inoxidável porque uma água contendo muito poucos íons puxa ativamente íons do aço inoxidável, cobre puro, porta de vidro e outros componentes da incubadora.

A água RO (osmose reversa) pode variar enormemente em termos de qualidade, porque a purificação é um processo de remoção percentual. Assim, se a água inicial tiver 500 ppm (partes por milhão), a água finalizada poderá ser 50 ppm, mas se a água inicial tiver 150 ppm, a água finalizada terá apenas 15 ppm. Nossa equipe de tecnologia realizou testes extensivos sobre a qualidade da água. Com base nesses testes e para uma longa vida útil da incubadora, recomendamos água destilada estéril com pH de 7-9 e condutividade de 1-20 microSiemens cm (resistividade de 50 K^-1 Mohm/cm).

Mesmo a água destilada estéril pode ter um pH muito baixo, por isso teste-a. Se apenas DI ou água ultrapura estiver disponível no laboratório, recomendamos o uso de água com uma faixa de resistência de 1-10 Mega ohms/cm. Certifique-se de que o pH está entre 7 e 9 e, em seguida, esterilize a água antes de usá-lo na incubadora. Note que, às vezes, sua fonte de obtenção de Tipo 1, DI ou água ultra-pura, na verdade, veio de um destilador, então, desde que os parâmetros que definimos sejam atendidos, essa água seria aceitável. Se você não tiver acesso a água destilada, uma opção para usar água tipo 1, DI ou ultrapura na incubadora é adicionar um pouco de bicarbonato de sódio à água para elevar o pH e adicionar alguns íons. Mas deve ser uma solução estéril do sal e você deve garantir que o pH final da água esteja na faixa de 7 a 9.

Manutenção Geral

A manutenção contínua da sua incubadora, além de uma verificação e calibração ocasionais de CO₂, é muito baixa. Se sua incubadora estiver equipada com filtragem HEPA, você deve substituir o filtro HEPA entre 6 meses a 1 ano. A vida útil de um filtro dependerá do número de pessoas que utilizam a incubadora e da limpeza geral do mesmo e do laboratório, bem como do projeto do fabricante. Manuseie um filtro HEPA somente pelo invólucro externo; não toque no meio filtrante. Antes de substituir um filtro HEPA em sua incubadora de CO2, inspecione visualmente o meio filtrante para garantir que não haja quebras ou rasgos. Se houver rupturas ou rasgos, descarte esse filtro e use outro.

Você também deve substituir os filtros de entrada de gás (onde o gás CO₂ entra na incubadora) entre 6 meses a 1 ano e simplesmente seguir as recomendações do fabricante para esse procedimento ou programar um especialista qualificado para fazer isso por você.

Com que frequência você deve executar o ciclo de esterilização por calor? A resposta depende da limpeza geral do laboratório, da quantidade de pessoas que utilizam a mesma incubadora, da frequência com que a porta é aberta e de como é conveniente desligar a incubadora durante a noite. A maioria dos usuários usa essa função de uma vez por mês para uma vez a cada seis meses.

Provavelmente, a coisa mais importante que você pode fazer para manter sua incubadora é manter um alto nível de água no reservatório de água. Se a bandeja ficar sem água, é extremamente ruim para as culturas de células, porque a umidade cai e isso leva à evaporação da água do seu meio de cultura. Assim, sem umidade adequada, os sais cuidadosamente equilibrados, minerais, aminoácidos, etc. em seu meio de crescimento tornam-se muito concentrados, o que pode levar à toxicidade e morte celular. Mas além do perigo para as células, umidade muito baixa também pode danificar o sensor de CO₂.

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